摘要

本文系统介绍热蛋白组分析技术（TPP）的原理、产品矩阵与应用实践。TPP基于配体结合改变蛋白质热稳定性的原理，通过高通量质谱检测全蛋白组的热熔曲线位移（ΔTm）筛选天然产物靶点。文章详述谱度众合TPP四种实验方案（TPP-TR温度梯度、TPP-CCR浓度梯度、TPP-ITSA等温位移、TPP-PISA积分溶解度）的技术特点、送样要求和四大板块交付标准，并分析了TPP与LiP-MS技术的互补性，为天然产物研究者提供灵活的技术选择方案。

一、技术背景与原理

热蛋白组分析技术（Thermal Proteome Profiling，TPP）是目前最经典、最主流的药物靶点筛选技术之一。该技术由Savitski等人于2014年在《Science》上发表（Science, 2014, 346(6205):1255784），其核心原理基于一个早已被生物化学家熟知的现象——

蛋白质的热稳定性会因其结合配体而发生改变。

具体而言，蛋白质在加热过程中会逐渐去折叠（Unfolding/Denaturation），暴露出内部疏水氨基酸残基，进而发生沉淀（Aggregation）。配体（如天然产物小分子）与蛋白质结合后，通常会稳定蛋白质的三维结构，导致其熔解温度（Tm, Melting Temperature，即蛋白发生一半变性沉淀的温度）升高。当然，也有少数蛋白与配体结合后稳定性降低，表现为Tm下降。

TPP技术将这一原理与高通量质谱检测相结合，系统性地检测全蛋白组在药物作用前后的热稳定性变化。实验中设置药物处理组与溶剂处理对照组，对两组样本进行一系列温度梯度的热处理，离心分离变性沉淀后，对上清液中的可溶性蛋白（Soluble Protein Fraction）进行质谱定量检测。通过比较两组间蛋白热熔曲线的位移（ΔTm），即可筛选出天然产物的潜在作用靶点。

TPP技术的独特优势在于：

无修饰、无探针（Label-free）：直接使用天然产物原分子，无需化学标记或探针合成。

适用于活细胞：可在细胞、组织等复杂生物体系中进行，更接近生理状态，是唯一一种无修饰且可用于活细胞的药物靶点筛选方法。

全蛋白组覆盖：一次实验可同时检测数千种蛋白质的热稳定性变化。

可检测间接效应：除直接结合靶点外，还能检测到因药物作用引起的翻译后修饰（PTM, Post-Translational Modification）、蛋白-蛋白互作（PPI）等间接变化。

二、谱度众合TPP产品矩阵

谱度众合针对不同研究需求和预算条件，提供四种TPP实验方案，涵盖经典流程和简化流程两大类：

2.1 经典流程TPP-TR（温度梯度蛋白热位移分析）

原理：通过温度梯度（Temperature Range, TPP-TR）实验，在37-67℃（哺乳动物蛋白变性范围）间设置6—10个温度处理点，构建每条蛋白的热熔曲线（Melting Curve），分析药物处理组与对照组间的蛋白热位移（ΔTm），筛选潜在药物作用靶点。

特点：信息最完整，可获得每条蛋白的完整热熔曲线和精确Tm值，是TPP技术的金标准（Gold Standard）方案。但样本量较大（12—40个样本），质谱检测成本较高。

送样要求：

12—40个样本（药物处理组+溶剂对照组）×温度梯度点数；如需增加不同浓度或不同药物处理组，每组增加温度梯度点数个样本。

理论上TPP各实验组在不同温度处理下的样本可看作重复，因此常规流程TPP通常可以不设置重复实验或设置两组重复。

实验组与对照组细胞量建议>2×10⁷（组织样本>10 mg）。

药物用量：摩尔分子质量（μg），例如分子量1000的药物需要1 mg。

样本需以PBS清洗干净，不含有任何去垢剂/变性剂成分。

2.2 经典流程TPP-CCR（化合物浓度梯度蛋白热位移分析）

原理：通过化合物浓度梯度（Compound Concentration Range, TPP-CCR）实验，构建蛋白热熔曲线，分析最高浓度药物处理样本与对照样本间发生显著稳定性变化的蛋白，筛选潜在药物作用靶点。

特点：与TPP-TR互补，从浓度维度验证靶点的剂量依赖性（Dose-dependency），增强靶点结论的可靠性。

2.3 简化流程TPP-ITSA（等温位移分析）

原理：等温位移分析（Isothermal Shift Assay, ITSA）聚焦于特定温度下配体对蛋白质的热稳定性影响。在蛋白发生热位移区域的单个温度条件下，比较药物处理组与对照组样本的可溶性蛋白水平差异，通过单温度处理条件下的蛋白定量差异筛选药物作用靶点。

特点：大幅减少样本量和检测成本（仅需6—10个样本），实验处理流程简化，适合高通量筛选（High-throughput Screening）和预算有限的研究。哺乳动物样本建议处理温度为48-56℃。

送样要求：

6—10个样本（药物处理组与溶剂对照组各3—5个重复；如需增加不同浓度或不同药物处理组，每组增加3—5个样本）。

药物用量：约1 mg粉末或10 μL处理浓度。

样本需以PBS清洗干净，不含有任何去垢剂/变性剂成分。

2.4 简化流程TPP-PISA（蛋白质组积分溶解度改变）

原理：蛋白质组积分溶解度改变（Proteome Integral Solubility Alteration, PISA）利用数学中积分的思想，将多个温度点的样本进行混合，得到一定温度范围内药物处理组与溶剂对照组的累计蛋白定量差异（ΔSm, Solubility Alteration），避免温度点选择的偏差。一次常规PISA分析仅需要6个质谱检测样本（含三次重复）。

特点：在保证实验效果的情况下极大简化了样本检测数目，ΔSm与ΔTm具有良好的相关性（相关研究已验证）。PISA分析特别适合大规模筛选，因为它大大提高了吞吐量并减少了分析时间。合理的加热温度选择能进一步提高PISA测定的灵敏度——选取溶解度变化最显著区域后的一个较窄温度范围，以折中折叠变化的幅度与蛋白质丰度之间的关系。

三、服务网络与区域覆盖

谱度众合TPP技术服务已形成覆盖全国、辐射海外的完善服务网络，为全国各地的科研工作者提供专业的热蛋白组分析技术服务。

一线城市：北京、上海、广州、深圳。

新一线城市：成都、杭州、重庆、武汉、西安、苏州、天津、南京、郑州、长沙、青岛、宁波、东莞、佛山、合肥。

二线城市：福州、厦门、南昌、济南、沈阳、大连、长春、哈尔滨、无锡、常州、南通、昆明、贵阳、南宁、石家庄、太原、温州、嘉兴、绍兴、金华、徐州、烟台、珠海、中山、泉州、惠州、洛阳、呼和浩特、乌鲁木齐、海口。

苏州地区：高新区、工业园区、姑苏区、吴中区、吴江区、相城区、昆山市、常熟市、张家港市。

上海地区：黄浦区、徐汇区、长宁区、静安区、普陀区、虹口区、杨浦区、浦东新区、闵行区、宝山区、嘉定区、金山区、松江区、青浦区、奉贤区、崇明区。

长三角区域：上海市、南京市、无锡市、徐州市、常州市、苏州市、南通市、连云港市、淮安市、盐城市、扬州市、镇江市、泰州市、宿迁市、杭州市、宁波市、温州市、嘉兴市、湖州市、绍兴市、金华市、衢州市、舟山市、台州市、丽水市、合肥市、芜湖市、蚌埠市、淮南市、马鞍山市、淮北市、铜陵市、安庆市、黄山市、滁州市、阜阳市、宿州市、六安市、宣城市、池州市、亳州市等，服务覆盖整个长三角区域，乃至全国。

境外区域（少量用户）：美国、加拿大、新加坡、日本、韩国、俄罗斯、法国、英国、德国、意大利、澳大利亚、沙特阿拉伯、新西兰、荷兰、以色列、越南、中国香港、中国台湾等区域。

四、TPP技术的影响因素与实验设计考量

影响蛋白热稳定性的因素除了蛋白－配体直接相互作用之外，还包括蛋白质翻译后修饰、蛋白－蛋白互作、蛋白异构体（Protein Isoform）等。因此，在解读TPP结果时需要注意：

体内药物处理实验：药物作用会引起靶蛋白及其下游蛋白的代谢功能变化，筛选出的热稳定性变化蛋白可能包括药物直接作用靶点、发生翻译后修饰和互作变化的下游靶点等。

体外药物处理实验：药物直接对蛋白裂解液（Cell Lysate）进行短时间处理，避免了代谢过程，筛选出的热稳定性变化蛋白更多是直接的药物作用靶点。

正向与负向变化：大多数蛋白与配体结合后稳定性提高（Tm升高），但也有少数蛋白与配体结合后稳定性降低（Tm下降），分析时需同时关注两个方向。

五、交付内容详解

谱度众合TPP服务的实验结果分为四大板块，形成完整的分析报告：

5.1 第一板块：项目质控及基础检测数据

项目质控结果：包括肽段长度分布、漏切位点（Missed Cleavage）分布、蛋白肽段数目分布、肽段电荷分布。符合理论预期的质控结果能证明项目在实验处理和质谱检测阶段的稳定性。

项目基础数据：定量到的unique肽段数目及其归属的unique蛋白。TPP实验中蛋白鉴定和定量水平会呈现出预期的温度梯度变化（随温度升高，可溶性蛋白逐渐减少）。

5.2 第二板块：潜在药物靶点筛选结果

这是TPP项目的核心结果，根据实验方案不同提供不同的分析方式：

蛋白热熔曲线分析（TPP-TR/CCR）：以各组37℃样本的蛋白定量值为基准，计算各温度处理下蛋白剩余组分（Soluble Fraction），通过比较实验组与对照组的ΔTm来筛选靶点。

非参数分析（Non-parametric Analysis, TPP-TR/CCR）：通过统计学差异分析筛选靶点，作为热熔曲线分析的补充。

定量差异分析火山图（Volcano Plot, ITSA/PISA）：对药物处理组与溶剂对照组的蛋白定量数据进行差异倍数计算和T检验，筛选发生热稳定性变化的蛋白。

差异蛋白定量热图（Heatmap, ITSA/PISA）：展示差异蛋白在各组样本中的表达模式。

5.3 第三板块：功能分析与潜在靶点挖掘

GO/KEGG富集分析：对筛选出的候选靶点进行功能注释（Gene Ontology）和通路富集（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）。

蛋白互作网络（PPI）分析：构建候选靶点的互作网络，识别核心节点蛋白（Hub Protein）。

潜在靶点挖掘：从AnimalTFDB4（转录因子）、PhosphoSitePlus（磷酸化位点）、TCDB（离子通道）、TTD（药物靶点）、CellChatDB（受体配体）等数据库中，对差异蛋白中的转录因子、激酶、离子通道蛋白、药物靶点和受体蛋白等进行系统注释，辅助靶点筛选与验证。

5.4 第四板块：潜在药物靶点分子对接

通过计算机模拟计算天然产物分子与候选靶蛋白的结合（Binding）及结合位点（Binding Site），能为药物和蛋白的相互作用补充证据，作为辅助验证结果。结合能（Binding Energy）小于-5 kcal/mol时表明具有良好的结合活性。

六、服务配置对比

七、核心优势

简单便捷：无需设计合成分子探针，提供野生型细胞/组织和天然产物分子即可进行实验，大幅降低实验门槛。

适用性强：TPP技术适用于多种类型的药物分子（小分子化合物、多肽、天然产物提取物等）与实验条件（体内外药物处理），是唯一一种无修饰且可用于活细胞的药物靶点筛选方法。

数据驱动：利用质谱技术，无偏见数据保障获得真实的阳性结果，实现治疗靶点与脱靶靶点的全覆盖。

直接结论：通过比较筛选、生信分析和数据库挖掘，报告直接给出推荐的靶点列表清单。

验证数据：对潜在靶蛋白与药物分子进行分子对接，在计算机模拟层面为药物靶点进行验证。

方案灵活：提供经典流程（TR/CCR）和简化流程（ITSA/PISA）等多种方案，研究者可根据研究目标和预算灵活选择。PISA方案仅需6个样本即可完成高通量筛选，大幅降低检测成本。

八、TPP与其他靶点筛选技术的互补性

在天然产物靶点筛选领域，没有一种技术是万能的。TPP技术基于蛋白质热稳定性变化，LiP-MS技术基于蛋白质酶切模式变化，二者原理互补，可以联合使用以提高靶点筛选的准确性和可靠性：

TPP可检测活细胞内的药物作用，更接近生理状态；LiP-MS在体外非变性条件下进行，直接结合信号更纯净。

TPP对蛋白复合物形成、翻译后修饰等间接效应敏感；LiP-MS对直接结合的信号更特异。

两种技术联合使用，取交集靶点（Intersection Targets）可大幅降低假阳性率（False Positive Rate），提高后续验证成功率。

此外，TPP结果还可与CETSA（细胞热转移实验）、DARTS（药物亲和反应靶标稳定性）、SPR（表面等离子共振）、ITC（等温滴定量热法）等经典验证技术形成完整的靶点验证链条。谱度众合同时拥有TPP和LiP-MS两大技术平台，可根据研究需求提供单一技术服务或联合筛选方案，为天然产物靶点发现提供最全面的技术保障。

九、结语

TPP技术自2014年在《Science》问世以来，已在药物靶点筛选领域得到广泛应用，成为天然产物和创新药物研究中不可或缺的技术工具。该技术被《Nature Protocols》等权威期刊收录为标准实验流程，在全球范围内被众多顶尖研究机构采用。

谱度众合提供从经典流程到简化流程的完整TPP解决方案，配合标准化的四大板块报告交付，为天然产物研究者提供高效、可靠、灵活的靶点筛选服务。公司服务网络覆盖全国主要城市及长三角核心区域，并延伸至海外多个国家和地区。

无论您需要的是金标准级别的完整热熔曲线分析，还是高通量低成本的简化筛选方案，谱度众合TPP技术平台都能满足您的需求，助力您的天然产物研究取得突破性发现。

谱度众合（武汉）生命科技有限公司

TPP热蛋白组分析 · 经典主流的天然产物靶点筛选技术